Измерение ферментативной активности. Факторы, определяющие активность ферментов

Ферменты - это катализаторы химических реакций белковой природы, отличающиеся специфичностью действия в отношении катализа определенных химических реакций. Они являются продуктами биосинтеза всех живых почвенных организмов: древесных и травянистых растений, мхов, лишайников, водорослей, микроорганизмов, простейших, насекомых, беспозвоночных и позвоночных животных, представленных в природной обстановке определенными совокупностями - биоценозами.

Биосинтез ферментов в живых организмах осуществляется благодаря генетическим факторам, ответственным за наследственную передачу типа обмена веществ и его приспособительную изменчивость. Ферменты являются тем рабочим аппаратом, при помощи которого реализуется действие генов. Они катализируют в организмах тысячи химических реакций, из которых в итоге слагается клеточный обмен. Благодаря им химические реакции в организме осуществляются с большой скоростью.

В настоящее время известно более 900 ферментов. Их подразделяют на шесть главных классов.

1. Оксиредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.

2. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных химических групп и остатков.

3. Гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей.

4. Лиазы, катализирующие реакции присоединения групп по двойным связям и обратные реакции отрыва таких групп.

5. Изомеразы, катализирующие реакции изомеризации.

6. Лигазы, катализирующие химические реакции с образованием связей за счет АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты).

При отмирании и перегнивании живых организмов часть их ферментов разрушается, а часть, попадая в почву, сохраняет свою активность и катализирует многие почвенные химические реакции, участвуя в процессах почвообразования и в формировании качественного признака почв - плодородия. В разных типах почв под определенными биоценозами сформировались свои ферментативные комплексы, отличающиеся активностью биокаталитических реакций.

В. Ф. Купревич и Т. А. Щербакова (1966) отмечают, что важной чертой ферментативных комплексов почв является упорядоченность действия имеющихся групп ферментов, которая проявляется в том, что обеспечивается одновременное действие ряда ферментов, представляющих различные группы; исключаются образование и накопление соединений, имеющихся в почве в избытке; излишки накопившихся подвижных простых соединений (например, NH 3) тем или иным путем временно связываются и направляются в циклы, завершающиеся образованием более или менее сложных соединений. Ферментативные комплексы являются уравновешенными саморегулирующимися системами. В этом основную роль играют микроорганизмы и растения, постоянно пополняющие почвенные ферменты, так как многие из них являются короткоживущими. О количестве ферментов косвенно судят по их активности во времени, которая зависит от химической природы реагирующих веществ (субстрата, фермента) и от условий взаимодействия (концентрации компонентов, рН, температуры, состава среды, действия активаторов, ингибиторов и т.д.).

В данной главе рассматривается участие в некоторых химических почвенных процессах ферментов из класса гидролаз - активность инвертазы, уреазы, фосфатазы, протеазы и из класса оксиредуктаз - активность каталазы, пероксидазы и полифенолоксидазы, имеющих большое значение в превращении азот- и фосфорсодержащих органических веществ, веществ углеводного характера и в процессах образования гумуса. Активность этих ферментов - существенный показатель плодородия почв. Кроме того, будет охарактеризована активность этих ферментов в лесных и пахотных почвах разной степени окультуренности на примере дерново-подзолистых, серых лесных и дерново-карбонатных почв.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Инвертаза - катализирует реакции гидролитического расщепления сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы, воздействует также на другие углеводы с образованием молекул фруктозы - энергетического продукта для жизнедеятельности микроорганизмов, катализирует фруктозотрансферазные реакции. Исследования многих авторов показали, что активность инвертазы лучше других ферментов отражает уровень плодородия и биологической активности почв.

Уреаза- катализирует реакции гидролитического расщепления мочевины на аммиак и диоксид углерода. В связи с использованием мочевины в агрономической практике необходимо иметь в виду, что активность уреазы выше у более плодородных почв. Она повышается во всех почвах в периоды их наибольшей биологической активности - в июле - августе.

Фосфатаза (щелочная и кислая) - катализирует гидролиз ряда фосфорорганических соединений с образованием ортофосфата. Активность фосфатазы находится в обратной зависимости от обеспеченности растений подвижным фосфором, поэтому она может быть использована как дополнительный показатель при установлении потребности внесения в почвы фосфорных удобрений. Наиболее высокая фосфатазная активность в ризосфере растений.

Протеазы - это группа ферментов, при участии которых белки расщепляются до полипептидов и аминокислот, далее они подвергаются гидролизу до аммиака, диоксида углерода и воды. В связи с этим протеазы имеют важнейшее значение в жизни почвы, так как с ними связаны изменение состава органических компонентов и динамика усвояемых для растений форм азота.

Каталаза - в результате ее активирующего действия происходит расщепление перекиси водорода, токсичной для живых организмов, на воду и свободный кислород. Большое влияние на каталазную активность минеральных почв оказывает растительность. Как правило, почвы, находящиеся под растениями с мощной глубоко проникающей корневой системой, характеризуются высокой каталазной активностью. Особенность активности каталазы заключается в том, что вниз по профилю она мало изменяется, имеет обратную зависимость от влажности почв и прямую - от температуры.

Полифенолоксидаза и пероксидаза - им в почвах принадлежит важная роль в процессах гумусообразования. Полифенолоксидаза катализирует окисление полифенолов в хиноны в присутствии свободного кислорода воздуха. Пероксидаза же катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей. При этом ее роль состоит в активировании перекисей, поскольку они обладают слабым окисляющим действием на фенолы. Далее может происходить конденсация хинонов с аминокислотами и пептидами с образованием первичной молекулы гуминовой кислоты, которая в дальнейшем способна усложняться за счет повторных конденсаций (Кононова, 1963).

Замечено (Чундерова, 1970), что отношение активности полифенолоксидазы (S) к активности пероксидазы (D), выраженное в процентах (), имеет связь с накоплением в почвах гумуса, поэтому эта величина получила название условный коэффициент накопления гумуса (К). У пахотных слабоокультуренных почв Удмуртии за период с мая по сентябрь он составил: у дерново-подзолистой - 24 %, у серой лесной оподзоленной - 26 и у дерново-карбонатной почвы - 29 %.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПОЧВАХ

Биокаталитическая активность почв находится в значительном соответствии со степенью обогащенности их микроорганизмами (табл. 11), зависит от типа почв и изменяется по генетическим горизонтам, что связано с особенностями изменения содержания гумуса, реакции, Red-Ox-потенциала и других показателей по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Как в одних, так и в других почвах все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или А п, имеют низкую активность ферментов, незначительно изменяющуюся в положительную сторону при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой оказывается резко сниженной, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных видах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

11. Сопоставление биогенносга и ферментативной активности почв Среднего Предуралья (Пухидская, Ковриго, 1974)

№ разреза, название почвы	Горизонт, глубина взятия образца, см	Общее количество микроорганизмов, тыс. на 1 г абс. сух. почвы (в среднем за 1962, 1964-1965 гг.)	Показатели активности ферментов (в среднем за 1969-1971 гг.)
			Инвертаза, мг глюкозы на 1 г почвы за I сут	Фосфатаза, мг фенолфталеина на 100 г почвы за 1 ч	Уреаза, мг NH, нa 1 г почвы за 1 сут	Каталаза, мл 0 2 на 1 г почвы за 1 мин	Полифенолоксидаза	Пероксидаза
			Инвертаза, мг глюкозы на 1 г почвы за I сут	Фосфатаза, мг фенолфталеина на 100 г почвы за 1 ч	Уреаза, мг NH, нa 1 г почвы за 1 сут	Каталаза, мл 0 2 на 1 г почвы за 1 мин	мг пурпурогаллина на 100 г почвы
3. Дерново-среднеподзолистая среднесуглинистая (под лесом)


				Не определяли
1.Дерново-средне-подзолистая средне-суглинистая слабоокультуренная


10.Сераялесная оподзоленная тяжел осуглинистая слабоокультуренная


2. Дерново-карбонатная слабовыщело-ченная л егкосуглинистая слабоокультуренная

Активность биокаталитических реакций почв изменяется. Наименьшая она весной и осенью, а наиболее высокая обычно в июле-августе, что соответствует динамике общего хода биологических процессов в почвах. Однако в зависимости от типа почв и их географического положения динамика ферментативных процессов весьма различна.

Контрольные вопросы и задания

1. Какие соединения называют ферментами? Каковы их продуцирование и значение для живых организмов? 2. Назовите источники почвенных ферментов. Какую роль играют отдельные ферменты в почвенных химических процессах? 3. Дайте понятие о ферментативном комплексе почв и его функционировании. 4. Дайте общую характеристику течения ферментативных процессов в целинных и пахотных почвах.

Ферменты - биологические катализаторы, высокомолекулярные вещества белковой природы, вырабатываемые живой клеткой. Они строго специфичны и играют важнейшую роль в обмене веществ микроорганизмов. Специфичность их связана с активными центрами, образуемыми группой аминокислот, т. е. каждый фермент реагирует с определенным химическим соединением или катализирует одну или несколько близких химических реакций. Например: фермент лактаза расщепляет лактозу, мальтаза - мальтозу и т. д.

Экзоферменты - выделяясь во внешнюю ере- Эндоферменты - участ-ду, расщепляют макромолекулы питательных Вуют в реакциях обмена веществ до более простых соединений, которые могут быть усвоены микробной клеткой (экзоферменты гидролиза вызывают гидролиз жиров, белков, углеводов).

Ферментный состав микроорганизмов является постоянным, а различные виды микробов четко различаются по набору ферментов. Поэтому изучение ферментативного состава имеет важное значение для идентификации различных микроорганизмов.

Практическое использование ферментативных свойств микробов: процессы брожения, грибы в пивоварении и виноделии, обработка шкур, для смягчения; консервирование. Приготовление биодобавок к стиральным порошкам, для удаления белковых загрязнений, так как они расщепляют белки до водорастворимых.

С помощью ферментов получают витамины, гормоны, алкалозы.

веществ, происходящих внутри клетки.

ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:

В жизнедеятельности бактерий ферменты играют важную роль, так как являются обязательными участниками разнообразных биохимических реакций, лежащих в основе функций питания, дыхания, размножения.

Устойчивость ферментативных систем бактерий позволяет использовать их биохимические свойства в сочетании с морфологическими и культуральными признаками для определения видов микроорганизмов.

Для обнаружения ферментов используют только чистые культуры микроорганизмов, которые засевают на специальные дифференциально-диагностические среды. Преимущественное значение при исследовании биохимической активности бактерий имеют сахаролитические, протеолитические и окислительно-восстановительные ферменты.

Сахаролитические ферменты микробов. Сахаролитическая активность микроорганизмов определяется по ферментативному расщеплению многоатомных спиртов и углеводов при посеве их на дифференциально-диагностические среды. Различные виды микробов при оптимальных условиях по-разному относятся к одним и тем же сахарам, расщепляя одни и оставаясь нейтральными по отношению к другим. Этосвойство микробов используется в бактериологической практике для дифференциации различных видов и разновидностей бактерий.

На плотных, жидких и полужидких питательных средах, содержащих различные индикаторы (чаще всего индикатор Андреде), сахара под действием сахаролитических ферментов бактерий расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются углекислый газ и водород. Накопление кислот снижает рН питательной среды, что приводит к изменению цвета индикатора и самой среды. Если бактерии не выделяют фермент к данному углеводу, то цвет индикатора и питательной среды не меняется. Поэтому набор питательных сред с индикаторами называют пестрым или цветным рядом.

Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий чаще всего засевают в цветные среды («пестрый ряд») Гисса (рец. 15) с углеводами и индикатором Андреде (рец. 16) или индикатором ВР (смесь водного голубого с розоловой кислотой). «Пестрый ряд» Гисса содержит обычно пять пробирок; с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. В некоторых случаях для более углубленного изучения биохимических свойств микроорганизмов «пестрый ряд» Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой. Сахара, применяемые для обнаружения сахаролитических ферментов, должны быть химически чистыми.

Среды Гисса бывают жидкие и полужидкие (с добавлением 0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими питательными средами опускают бродильную трубочку (поплавок), которая представляет собою стеклянную трубочку, запаянную с одного конца. При стерилизации поплавок полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют жидкость из поплавка с образованием воздушного колокола. В полужидких средах газообразование определяют по наличию пузырьков в толще среды.

Протеолитические ферменты микробов. Некоторые микроорганизмы продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада — пептоны, аминокислоты и полипептиды.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроорганизмов засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатину, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса.

Для определения протеолитической активности микроорганизмов на желатине готовят мясо-пептонную желатину (рец. 17) и разливают в пробирки столбиком по 5-6 мл. После застывания питательной среды производят посев уколом, погружая петлю в глубь питательной среды до дна пробирки.

Микробы, способные расти при низкой температуре, инкубируют при 20°С-22°С. Остальные посевы инкубируют при 37°С. При температуре 37°С желатина плавится, поэтому после инкубации вынутые пробирки помещают в холодильник или холодную воду для застывания среды. После застывания среды приступают к просмотру результатов роста микроорганизмов. При выделении протеолитического фермента желатиназы происходит расщепление белков и наблюдается разжижение питательной среды, с рисунком, характерным для определенных видов микроорганизмов (рис. 37). Например, сибиреязвенная палочка разжижает желатину желатину в виде воронки, стафилококки — в виде чулка, синегнойная палочка — послойно и т.д.

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

Различные формы разжижения желатины микроорганизмами

Определение протеолитической активности микробов на молочном агаре Эйкмана. Готовят молочный агар Эйкмана, для чего к 10 мл стерильного расплавленного питательного агара добавляют 3 мл обезжиренного молока и смешивают. Молочный агар Эйкмана (рец. 18) разливают в чашки Петри и после остывания засевают исследуемым микроорганизмом петлей штрихами или шпателем, чтобы получить изолированные колонии. Через 24-48 часов инкубации в термостате культуры, продуцирующие протеолитические ферменты, разлагают молочный белок — казеин, в результате чего вокруг колоний образуются четкие прозрачные зоны на фоне мутной питательной среды.

Дата публикования: 2015-11-01; Прочитано: 1165 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год.(0.001 с)…

Лекция № 3. Химическая структура, биохимические свойства и ферменты бактерий.

Клетка — универсальная единица живой материи. По химическому составу существенных отличий прокариотических и эукариотических клеток нет.

Химические элементы, входящие в состав живой материи, можно разделить на три основные группы.

1.Биогенные химические элементы (С, О, N, H). На их долю приходится 95% сухого остатка, в т.ч. 50%- C, 20%- O, 15%- N, 10%- H).

2.Макроэлементы — P, S,Cl, K, Mg, Ca, Na. На них приходится около 5 %.

3.Микроэлементы- Fe, Cu, I, Co, Mo и др. На них приходятся доли процента, однако они имеют важное значение в обменных процессах.

Химические элементы входят в состав различных веществ — воды, белков, липидов, нейтральных жиров, углеводов, нуклеиновых кислот. Синтез соединений контролируется генами. Многие вещества бактериальная клетка может получать извне — из окружающей среды или организма хозяина.

Вода составляет от 70 до 90 % биомассы. Содержание воды больше у капсульных бактерий, меньше всего- в спорах.

Белки встречаются во всех структурных элементах клетки. Белки могут быть более простые (протеины) и сложные (протеиды), в чистом виде или в комплексе с липидами, сахарами. Выделяют структурные (структурообразующие) и функциональные (регуляторные) белки, к последним относятся ферменты.

В состав белков входят как обычные для эукариотов аминокислоты, так и оригинальные- диаминопимелиновая, D-аланин, D-глютанин, входящие в состав пептидогликанов и капсул некоторых бактерий. Только в спорах находится дипиколиновая кислота , с которой связана высокая резистентность спор. Жгутики построены из белка флагеллина , обладающего сократительной способностью и выраженными антигенными свойствами. Пили (ворсинки) содержат особый белок — пилин .

Пептидную природы имеют капсулы представителей рода Bacillus, возбудителя чумы, поверхностные антигены ряда бактерий, в том числе стафилококков и стрептококков. Белок А — специфический белок S.aureus — фактор, обусловлавливающий ряд свойств этого возбудителя. Белок М — специфический белок гемолитических стрептококков серогруппы А, позволяющий дифференцировать серовары (около 100), что имеет эпидемиологическое значение.

Ряд белков содержит наружная мембрана грамотрицательных бактерий, из которых 3 — 4 мажорных (основных) и более 10- второстепенных, выполняющих различные функции. Среди мажорных белков- порины , образующие диффузные поры, через которые в клетку могут проникать мелкие гидрофильные молекулы.

Белки входят в состав пептидогликана — биополимера, составляющего основу бактериальной клеточной стенки. Он состоит из остова (чередующиеся молекулы двух аминосахаров) и двух наборов пептидных цепочек — боковых и поперечных. Наличие двух типов связей — гликозидных (между аминосахарами) и пептидных, которые соединяют субъединицы пептидогликанов, придают этому гетерополимеру структуру молекулярной сети . Пептидогликан- наиболее устойчивое соединение, которое образует ригидную мешковидную макромолекулу, определяющую постоянную форму бактерий и ряд их свойств .

1.Пептидогликан содержит родо- и видоспецифические антигенные детерминанты.

2.Он запускает классический и альтернативный пути активации системы комплемента.

3.Пептидогликан тормозит фагоцитарную активность и миграцию макрофагов.

4.Он способен инициировать развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

5.Пептидогликан обладает противоопухолевым действием.

6.Он оказывает пирогенное действие, т.е. вызывает лихорадку.

Из соединений белков с небелковыми компонентами наибольшее значение имеют липопротеиды, гликопротеиды и нуклеопротеиды .

Удивительное таинство жизни — синтез белка осуществляется в рибосомах . Существует два основных типа рибосом — 70S (S- константа седиментации, единица Сведберга) и 80S. Рибосомы первого типа встречаются только у прокариотов. Антибиотики не действуют на синтез белка в рибосомах типа 80S, распространенных у эукариотов.

Липиды (главным образом форфолипиды) содержатся в цитоплазматической мембране (липидный бислой), в также в наружной мембране грамотрицательных бактерий. Есть микроорганизмы, содержащие большое количество липидов (до 40% сухого остатка)- микобактерии. В состав липидов входят различные жирные кислоты , весьма специфичные для разных групп микроорганизмов. Их определение имеет в ряде случаев диагностическое значение, например у анаэробов, микобактерий.

У микобактерий туберкулеза в составе липидов имеется ряд кислотоустойчивых жирных кислот- фтионовая, миколовая и др. Высокое содержание липидов и их состав определяют многие свойства микобактерий туберкулеза:

Устойчивость к кислотам, щелочам и спиртам;

Трудная окрашиваемость красителями (используют специальные методы окраски, чаще- по Цилю- Нильсену);

Устойчивость возбудителя к солнечной радиации и дезосредствам;

— патогенность.

Тейхоевые кислоты встречаются в клеточных стенках грамположительных бактерий.

Представляют собой водорастворимые линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибола, связанные фосфодиэфирными связыми. С тейхоевыми кислотами связаны главные поверхностные антигены ряда грамположительных бактерий.

Углеводы встречаются чаще в виде полисахаридов , кторые могут быть экзо- и эндоклеточными. Среди экзоклеточных полисахаридов выделяют каркасные (входят в состав капсул) и истинно экзополисахариды (выходят во внешнюю среду). Среди бактериальных полисахаридов многие находят медицинское применение. Декстраны — полисахариды с большой молекулярной массой, по виду напоминают слизь. 6% раствор- кровезаменитель полиглюкин. Декстрановый гель сефадекс используется в колоночной хроматографии как молекулярное сито. Эндоклеточные полисахариды- запасные питательные вещества клетки (крахмал, гликоген и др.).

Липополисахарид (ЛПС) — один из основных компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий, это соединение липида с полисахаридом. ЛПС состоит из комплекса:

1.Липид А .

2.Одинаковое для всех грамотрицательных бактерий полисахаридное ядро.

3.Терминальная сахаридная цепочка (О- специфическая боковая цепь) .

Синонимы ЛПС- эндотоксин, О- антиген.

ЛПС выполняет две основные функции- определяет антигенную специфичность и является одним из основных факторов патогенности. Это- эндотоксин, токсические свойства которого проявляются преимущественно при разрушении бактериальных клеток. Его токсичность определяется липидом А. ЛПС запускает синтез более 20 биологически активных веществ, определяющих патогенез эндотоксикоза, обладает пирогенным действием.

Нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК. Рибонуклеиновые кислоты (РНК) находятся главным образом в рибосомах (р-РНК- 80- 85%), т(транспортные)- РНК- 10%, м(матричные)- РНК- 1- 2%, главным образом в одноцепочечной форме. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) может находиться в ядерном аппарате (хромосомная ДНК) или в цитоплазме в специализированных образованиях- плазмидах- плазмидная (внехромосомная) ДНК. Микроорганизмы отличаются по структуре нуклеиновых кислот, содержанию азотистых оснований . Генетический код состоит всего из четырех букв (оснований) — А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин). Наиболее часто для характеристики микроорганизмов используют как таксономический признак процентное соотношение Г/Ц, которое существенно отличается у различных групп микроорганизмов.

Микроорганизмы синтезируют различные ферменты — специфические белковые катализаторы. У бактерий обнаружены ферменты 6 основных классов .

1.Оксидоредуктазы- катализируют окислительно- восстановительные реакции.

2.Трансферазы- осуществляют реакции переноса групп атомов.

3.Гидролазы- осущесвляют гидролитическое расщепление различных соединений.

4.Лиазы- катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям.

5.Лигазы или синтетазы- обеспечивают соединение двух молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата.

6.Изомеразы — определяют пространственное расположение групп элементов.

В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов:

— конститутивные , синтез которых происходит постоянно;

— индуцибельные , синтез которых индуцируется наличием субстрата;

— репрессибельные , синтез которых подавляется избытком продукта реакции.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты . Экзоферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий- способность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие тканевые барьеры.

Примеры: гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, что повышает проницаемость тканей (клостридии, стрептококки, стафилококки и многие другие микроорганизмы); нейраминидаза облегчает преодоление слоя слизи, проникновение внутрь клеток и распространение в межклеточном пространстве (холерный вибрион, дифтерийная палочка, вирус гриппа и многие другие). К этой же группе относятся энзимы, разлагающие антибиотики.

В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов.

1.Сахаролитические.

2.Протеолитические.

3.Аутолитические.

4.Окислительно- восстановительные.

5.Ферменты патогенности (вирулентности).

Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белков- кислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный.

Основные ферменты вирулентности- гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии.

Ряд ферментов микроорганизмов широко используется в медицине и биологии для получения различных веществ (аутолитические, протеолитические), в генной инженерии (рестриктазы, лигазы).

Предыдущая12345678910111213141516Следующая

ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:

Ферменты бактерий. Ферментативная активность

Ферменты бактерий Ферменты являются высокоспецифичными биологическими катализаторами, без которых невозможны жизнь и размножение. Большое количество реакций, происходящих при жизни бактериальной клетки, указывает на существование у бактерий значительного количества ферментов. Ферменты - вещества белковой природы с большим молекулярным весом. Некоторые из них относятся к протеинам, другие являются сложными белками. Они построены из двух частей белка и небелковой части, называемой простетической группой. В состав ее могут входить витамины. нуклеотиды, атомы железа и пр. Связь между белковой частью фермента и го простетической группой может быть прочной и непрочной. При наличии непрочной связи в растворах наступает диссоциация фермента и при этом может освобождаться свободная простетическая группа.
Легко диссоциирующие иростетические группы ферментов называются коферментами. Обычно ферменты подразделяются на следующие основные группы:

1. Оксидоредуктазы. все ферменты, катализирующие окислительно восстановительные реакции.
2. Трансферазы. катализирующие перенос тех или иных групп (например аминогрупп, фосфатных остатков и т. д.
3.

Методы изучения ферментативной активности бактерий.

Гидролазы, расщепляющие путем гидролиза Гт или иные соединения; к этому классу относятся также фосфатазы и дезампназы - ферменты, отщепляющие соответственно гидролитическим путем фосфат или аммонийные группы от различных органических соединений.
4. Лиазы, ферменты, отщепляющие от субстратов негидролитическим путем определенные группы (например, СОг, НгО, SH2 и т. д.).
5. Изомеразы, катализирующие внутримолекулярные перестройки в субстрате.
6. Лигазы (синтетазы) - класс ферментов, катализирующих присоединение друг к другу двух молекул с одновременным разрывом ппрофосфатной связи в трифосфатах (например, образующие С-О, С-N или С-S связи).

Наиболее высокой ферментативной активностью обладают сапрофиты; в меньшей степени это свойство выражено у патогенных бактерий. Изучение ферментов патогенных бактерий имеет исключительно важное значение, так как на основании определения ферментативной активности микробов можно дифференцировать различные виды и определять природу того или иного возбудителя заболеваний. Наряду с этим ферментативная активность микробов определяет патогенез и клиническую картину инфекционного заболевания.
Ферменты дифференцируют на экзо и эндоферменты. Экзоферменты выделяются клеткой во внешнюю среду, осуществляют процессы расщепления высокомолекулярных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции.
Ферменты бактерий подразделяются на конституитивные и индуцибельные. К первой группе относятся те ферменты, которые синтезируются бактериальной клеткой вне зависимости от того, на какой среде бактерия выращивается. Индуцибельные ферменты продуцируются данной бактерией лишь в ответ на действие специфического индуктора, присутствующего в среде.

В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам:оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут локализоваться как внутри клетки - эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду - экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и - в некоторых случаях - для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

Идентификация бактерий по ферментативной активности

Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.

Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Через 3-5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты - индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

Для многих микроорганизмов таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2-6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают поплавки или используют полужидкие среды с 0,5% агара.

Для того чтобы определить интенсивное кислотообразование, характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный - при более низких значениях рН.

Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды.

При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса - Проскауэра на ацетоин - промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свидетельствует о наличии бутандиолового брожения.

Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1 % раствором перекиси водорода.

Для определения цитохромоксидазы применяют реактивы:

1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1;

2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидрохлорида.

О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2-5 мин.

Для определения нитритов используют реактив Грисса: появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

Ферментативные свойства бактерий

Для определения сахаролитических свойств из углеводов обычно используют лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, маннит. Результат реакции определяется при помощи добавляемых в питательную среду различных индикаторов, дающих цветные реакции. Поэтому метод посева на дифференциально-диагностические среды получил название посева на пестрый ряд. Иногда, в так называемый длинный пестрый ряд, добавляют арабинозу, ксилозу, галактозу, инулин, крахмал и др.

При разложении углеводов происходит образование органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газа (СО2 и Н2). Кислоты вызывают изменение рН среды, что приводит к из-менению ее цвета в результате реакции индикатора. Образую-щийся газ вытесняет жидкость в верхней части поплавка (при ис-пользовании жидкого пестрого ряда) или вызывает разрыв агара (при применении полужидких сахаров).

Среды для определения сахаролитических свойств

Среды Гисса состоят из пептонной воды, 1% углевода и ин-дикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации запол-няется средой. При сбраживании сахара бактериями, цвет среды меняется на красный, а газ скапливается в поплавке.

Полужидкие сахара состоят из 0,7% мясопептонного агара, 1% сахара и индикатора рН (водно-голубая краска и розоловая кислота). Посев производится уколом. При ферментации сахара цвет среды становится голубым, при наличии газообразования по ходу посева видны пузырьки газа, сам агар разрывается. В ла-бораторной практике широко применяются и другие дифферен-циально-диагностические среды, в состав которых входят сахара.

Протеолитические свойства бактерий (расщепление белков) определяются обнаружениемконечных продуктов ферментации белков (индола, сероводорода, аммиака) и по способности раз-жижать желатину (мясопептонный бульон с 10-15% желатин).

Разжижать желатину способны микробы, выделяющие фер-мент типаколлагеназы. Процесс разжижения идет сверху, при-чем различные виды микробов дают характерную для них фор-му, потому это свойство также используется в целях идентифи-кации бактерий.

Определение ферментации белков по конечным продуктам распада проводится при посеве на мясопептонный бульон или пептонную воду.

Таким образом, завершая работу по выделению чистой культуры, мы имеем данные о морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойствах выделенных культур бактерий. Это дает основание приступить к видовой идентификации – основной задаче последнего этапа бактерио-логического исследования. Для этого используют определитель Берги. Это справочное издание, каталог бактерий. В нем все микроорганизмы сгруппированы по основным биологическим свойствам. Сопо-ставляя свойства выделенных культур с приведенными в опреде-лителе, устанавливают их принадлежность к группе, семейству, ро-ду и, наконец, виду.

По морфологии, типу дыхания, тинкториальным свойствам, способности к спорообразованию находят таксономическую группу для идентифицируемой культуры. По полным морфологическим, тинкториальным свойствам, типу дыхания, спорообразованию, культуральным свойствам и неко-торым биохимическим признакам находят семейство, по методо-логическим особенностям (наличие капсул, жгутиков и т.д.), культуральным и биохимическим признакам определяют род, а внут-ри рода по биохимическим и антигенным свойствам устанавли-вают вид.

Cамостоятельная работа студента

На практическом занятии

Контрольные вопросы

1. Питание бактерий: аутотрофы и гетеротрофы.

2. Классификация питательных сред.

3. Условия культивирования микробов.

4. Требования, предъявляемые к питательным средам.

5. Химический состав микробов.

6. Понятие о чистой культуре и колониях.

7. Методы выделения чистых культур аэробных микробов.

8. Этапы выделения чистой культуры аэробных бактерий.

9. Культуральные свойства бактерий.

10. Биологическое окисление у аэробных и анаэробных бактерий.

11. Методы культивирования анаэробов.

12. Методы выделения чистых культур анаэробов.

13. Значение ферментов в идентификации бактерий.

Тема:«Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Действие физических и химических факторов. Стерилизация и дезинфекция»

Цель:

– научиться методам стерилизации лабораторной по-суды и

питательных сред.

Задачи:

– уметь правильно подобрать соответствующий метод стерилизации

различных объектов (среда, посуда, инструменты и т.д.);

– освоить основные группы дезинфицирующих ве-ществ и механизм

их действия на бактерии.

Во внешней среде на микробы действуют физические, хими-ческие и биологические факторы, которые или угнетают, или стимулирует их жизнедеятельность.

К физическим факторам относятся: высокая и низкая темпе-ратура, высушивание, лучистая энергия, ультразвук, высокое давление.

Температура . Физиологическая деятельность любого микроорганизма приспособлена к определенному температурному оптимуму. По отношению к температуре все микроорганизмы делятся на психрофилы (от 0 до +10°С), мезофилы (от +20°С до +40°С) и термофилы (+50°С – +70°С). Большинство патогенных микроорганизмов относится к мезофилам.

Большинство микроорганизмов устойчивы к низким температурам (исключение составляют гонококки и менингококки).

Ферментативная активность бактерий

Высокая температура (+50°С – +60°С) губительно действует на вегетативные формы бактерий. Споры выдерживают кипячение до 2 часов. Губительное действие высокой температуры и лежит в основе методов стерилизации.

Основные противоэпидемические мероприятия

В лаборатории

Стерилизация

Стерилизация — удаление или уничтожение всех живых микроорганизмов (вегетативных и споровых форм) внутри или на поверхности предметов.

Стерилизация проводится различными методами: физическими, химическими,механическими.

Основные требования, предъявляемые к процессу стерилизации, отражены в отраслевом стандарте 42-21-2-82 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства, режимы».

Физические методы

Самым распространенным методом стерилизации является воздействие высокой температуры. При температуре, приближающейся к 100 °С, происходит гибель большинства патогенных бактерий и вирусов. Споры почвенных бактерий-термофилов погибают при кипячении в течение 8,5 часов. Микроорганизмы, попавшие в глубинные слои земли, или покрытые свернувшейся кровью, оказываются защищенными от воздействия высокой температуры и сохраняют свою жизнеспособность.

При стерилизации физическими методами применяют действие высоких температур, давления, ультрафиолетового облучения и др.

Наиболее простой, но надежный вид стерилизации — прокаливание . Его применяют при поверхностной стерилизации негорючих и теплоустойчивых предметов непосредственно перед их использованием.

Другим простым и легко доступным методом стерилизации считается кипячение . Этот процесс проводят в стерилизаторе - металлической коробке прямоугольной формы с двумя ручками и плотно закрывающейся крышкой. Внутри расположена вынимающаяся металлическая сетка с ручками по бокам, на которую кладут стерилизуемый инструмент. Основной недостаток метода заключается в том, что он не уничтожает споры, а только вегетативные формы.

При паровой стерилизации необходимо выполнение определенных условий, которые гарантируют ее эффективность и сохранение стерильности изделий в течение определенного срока. Прежде всего, стерилизация инструментов, операционного белья, перевязочного материала должна проводиться в упаковке. С этой целью используют: стерилизационные коробки (биксы), двойную мягкую упаковку из бязи, пергамент, влагопрочную бумагу (крафт-бумага), полиэтилен высокой плотности.

Обязательное требование к упаковке — герметичность. Сроки сохранения стерильности зависят от вида упаковки и составляют трое суток для изделий простерилизованных в коробках без фильтров, в двойной мягкой упаковке из бязи, бумаги мешочной влагопрочной. В стерилизационных коробках с фильтрами стерильность изделий сохраняется в течение года.

Стерилизация сухим жаром

Процесс стерилизации сухим жаром проводят в сухожаровом шкафу (в печи Пастера и др.) — металлическом шкафу с двойными стенками. В корпусе шкафа расположены рабочая камера, в которой имеются полки для размещения предметов для обработки, и нагревательные элементы, которые служат дляравномерного нагрева воздуха в рабочей камере.

Режимы стерилизации:

температура 150 °С – 2 часа;

температура 160 °С – 170 °С – 45 минут — 1час;

температура 180 °С – 30 минут;

температура 200 °С – 10-15 минут.

Необходимо помнить, что при температуре 160 °С бумага и вата желтеют при более высокой температуре - сгорают (обугливаются). Началом стерилизации является тот момент, когда температура в печи достигает нужной величины. После окончания стерилизации печь выключается, прибор остывает до 50 °С, после чего из него вынимают простерилизованные предметы.

Изделия в воздушном стерилизаторе можно стерилизовать без упаковки, но только в тех случаях, если они используются сразу же после стерилизации. В качестве упаковки может быть использована бумага мешочная, изготовленная по ГОСТ 2228-81, в ней изделия хранятся не менее 3-х суток.

Режим воздушной стерилизации представлен двумя значениями температуры – 160 °С в течение 2,5 часов, либо 180 °С – в течение 1 часа.

Стерилизация текучим паром

Этот вид стерилизации производится в аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Кохапредставляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата не плотно, для того,чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Начальный подогрев воды в приборе происходит в течение 10-15 минут.

Текучим паром стерилизуют материалы, которые разлагаются или портятся при температуре выше 100 °С — питательные среды с углеводами, витаминами, растворы углеводов и т. п.

Стерилизацию текучим паром проводят дробным методом – при температуре не выше 100 оС по 20-30 минут в течение 3-х дней. При этомвегетативные формы бактерий погибают, а споры сохраняют жизнеспособность и прорастают в течение суток при комнатной температуре. Последующее прогревание обеспечивает гибель этих вегетативных клеток, появляющихся из спор в промежутках между этапами стерилизации.

Тиндализация – метод дробной стерилизации, при котором прогревание стерилизуемого материала проводится при температуре 56-58 оС в течение часа 5-6 дней подряд.

Пастеризация – однократное нагревание материала до 50-65 °С (в течение 15-30 минут), 70-80 °С (в течение 5-10 минут). Используется для уничтожения бесспоровых форм микробов в пищевых продуктах (молоко, соки, вино, пиво).

Предыдущая1234567891011121314Следующая

Активность ферментов. Под активностью фермента понимают такое его количество, которое катализирует превращение определенного количества субстрата в единицу времени. Для выражения активности препаратов ферментов используют две альтернативные единицы: международную (МЕ) и катал (кат). За международную единицу активности фермента принято такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в продукт за 1 мин в стандартных условиях (обычно оптимальных). Один катал обозначает количество фермента, катализирующее превращение 1 моля субстрата за 1 с (1 кат = 6 ∙ 10 7 МЕ). При бимолекулярной реакции A + В = С + D за единицу активности фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоля А или В, или 2 мкмолей А (если В = А), за 1 мин.

Часто ферментные препараты характеризуются удельной активностью, которая отражает степень очистки фермента. Удельная активность – это число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг белка.

Молекулярная активность (число оборотов фермента) – число молекул субстрата, подвергающееся превращению одной молекулой фермента за 1 мин при полном насыщении фермента субстратом. Она равна числу единиц активности фермента, деленному на количество фермента, выраженное в микромолях. Понятие молекулярной активности применимо только для чистых ферментов.

Когда известно количество активных центров в молекуле фермента, вводится понятие активности каталитического центра . Она характеризуется числом молекул субстрата, которое подвергается превращению за 1 мин в расчете на один активный центр.

Активность ферментов сильно зависит от внешних условий, среди которых первостепенное значение имеют температура и рН среды. Повышение температуры в интервале 0−50°С обычно приводит к плавному увеличению ферментативной активности, что связано с ускорением процессов формирования фермент-субстратного комплекса и всех последующих событий катализа. При повышении температуры на каждые 10°С скорость реакции увеличивается примерно вдвое (правило Вант-Гоффа). Однако дальнейшее возрастание температуры (>50°С) сопровождается повышением количества инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части, что выражается в снижении активности. Каждый фермент характеризуется температурным оптимумом – значением температуры, при котором регистрируется наибольшая его активность.

Зависимость активности ферментов от значения рН среды имеет сложный характер. Для каждого фермента характерен оптимум рН среды , при котором он проявляет максимальную активность. При удалении от этого значения в ту или другую сторону ферментативная активность снижается. Это объясняется изменением состояния активного центра фермента (уменьшением или увеличением ионизации функциональных групп), а также третичной структуры всей белковой молекулы, которая зависит от соотношения в ней катионных и анионных центров. Большинство ферментов имеют оптимум рН в области нейтральных значений. Однако есть ферменты, проявляющие максимальную активность при рН 1,5 (пепсин) или 9,5 (аргиназа). При работе с ферментами необходимо поддерживать рН с помощью соответствующего буферного раствора.

Активность ферментов подвержена значительным колебаниям в зависимости от воздействия ингибиторов (веществ, частично или полностью снижающих активность) и активаторов (веществ, увеличивающих активность). Их роль выполняют катионы металлов, некоторые анионы, переносчики фосфатных групп, восстановительных эквивалентов, специфические белки, промежуточные и конечные продукты метаболизма и др.

Принципы ферментативной кинетики. Суть кинетических исследований состоит в определении максимальной скорости ферментативной реакции (V max) и константы Михаэлиса К М. Ферментативная кинетика изучает скорости количественных превращений одних веществ в другие под действием ферментов. Скорость ферментативной реакции измеряют по убыли субстрата или приросту образующегося продукта за единицу времени, либо по изменению концентрации одной из смежных форм кофермента.

Влияние концентрации фермента на скорость реакции выражается в следующем: если концентрация субстрата постоянна (при условии избытка субстрата), то скорость реакции пропорциональна концентрации фермента. Для кинетических исследований используют концентрацию фермента 10  8 М активных центров. Оптимальное значение концентрации фермента определяют из графика зависимости активности фермента от его концентрации. Оптимальным считается значение, лежащее на плато полученного графика в области значений активности фермента, мало зависящих от его концентрации (рис. 4.3).

Рис. 4.3. Зависимость скорости ферментативной реакции

от концентрации фермента

Для изучения влияния концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции сначала строят кинетическую кривую, отражающую изменение концентрации субстрата (S 1) или продукта (Р 1) во времени (рис. 4.4) и измеряют начальную скорость (V 1) реакции как тангенс угла наклона касательной к кривой в нулевой точке.

Рис. 4.4. Кинетические кривые ферментативной реакции

Построив кинетические кривые для других значений концентрации данного субстрата (S 2 , S 3 , S 4 и т. д.) или продукта (Р 2 , Р 3 , Р 4 и т. д.) и определив начальные скорости (V 2, V 3 , V 4 и т. д.) реакции, строят график зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (при постоянной концентрации фермента), который имеет вид гиперболы (рис. 4.5).

Рис. 4.5. Зависимость начальной скорости ферментативной реакции

от концентрации субстрата

Кинетика многих ферментативных реакций описывается уравнением Михаэлиса  Ментен. При постоянной концентрации фермента и малых значениях концентрации субстрата [S] начальная скорость реакции прямо пропорциональна [S] (рис. 4.5). В этом случае говорят о полунасыщении фермента субстратом, когда половина молекул фермента находится в форме фермент-субстратного комплекса и скорость реакции V = 1/2V max . В отношении субстрата реакция имеет 1-й порядок (скорость реакции прямо пропорциональна концентрации одного реагирующего вещества) или 2-й порядок (скорость реакции пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ).

При высоких значениях концентрации субстрата [S] скорость реакции почти не зависит от [S]: при дальнейшем увеличении [S] скорость реакции растет все медленнее и в итоге становится постоянной (максимальной) (рис. 4.5). При этом достигается полное насыщение фермента субстратом, когда все молекулы фермента находятся в форме фермент-субстратного комплекса и V = V max . В отношении субстрата реакция имеет 0-й порядок (скорость реакции не зависит от концентрации реагирующих веществ).

В 1913 г. Л. Михаэлис и М. Ментен предложили простую модель, объясняющую такую кинетику. Согласно этой модели, образование специфического фермент-субстратного комплекса является необходимым промежуточным этапом катализа.

k 1 k 3

Е + S ⇄ ЕS → Е + Р

Фермент Е соединяется с субстратом S, образуя ЕS-комплекс. Константа скорости этого процесса k 1 . Судьба ЕS-комплекса складывается двояко: он может либо диссоциировать на фермент Е и субстрат S с константой скорости k 2 , либо подвергнуться дальнейшему превращению, образуя продукт Р и свободный фермент Е, с константой скорости k 3 . При этом постулируется, что продукт реакции не превращается в исходный субстрат. Это условие соблюдается на начальной стадии реакции, пока концентрация продукта невелика.

Скорость катализа определяют в стационарных условиях , когда концентрация промежуточных продуктов остается постоянной, тогда как концентрация исходных веществ и конечных продуктов изменяется. Это имеет место в том случае, когда скорость образования ЕS-комплекса равна скорости его распада.

Можно ввести новую константу К М – константу Михаэлиса (моль/л), которая равна

Уравнение Михаэлиса – Ментен , выражающее количественное соотношение между скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата, имеет вид

(4.2)

Это уравнение соответствует графику зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. При низких концентрациях субстрата , когда [S] намного ниже К М, V = V max [S] / К М, т. е. скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата. При высоких концентрациях субстрата , когда [S] намного выше К М, V = V max , т. е. скорость реакции максимальна и не зависит от концентрации субстрата.

Если [S] = К М, то V = V max /2.

Таким образом, К М равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной .

Константа Михаэлиса (К М) и максимальная скорость реакции (V max) – важные характеристики скорости при разных концентрациях субстрата. V max – величина постоянная для каждого фермента позволяет оценить эффективность его действия.

Константа Михаэлиса показывает сродство субстрата к ферменту (в случае, когда k 2 >> k 3): чем меньше К М, тем больше сродство и выше скорость реакции, и наоборот. Каждый субстрат характеризуется своей величиной К М для данного фермента и по их значениям можно судить о субстратной специфичности фермента. Константа Михаэлиса зависит от природы субстрата, температуры, рН, ионной силы раствора и наличия ингибиторов.

В связи с тем, что определение V max и К М непосредственно из графической зависимости Михаэлиса – Ментен (рис.4.5) является неоднозначным, прибегают к линеаризации данного уравнения. Для этого его преобразуют в такую форму, чтобы графически оно выражалось прямой. Существует несколько методов линеаризации, среди которых наиболее часто применяют методы Лайнуивера – Бэрка и Эди – Хофсти.

Преобразование Лайнуивера – Бэрка имеет вид

(4.3)

Строят график зависимости 1/V = f (1/[S]) и получают прямую линию, пересечение которой с осью ординат дает величину 1/V max ; отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс дает величину −1/К М, а тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс равен К М /V max (рис. 4.6). Этот график позволяет более точно определять V max. Как мы увидим ниже, из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирования активности фермента.

Рис. 4.6. Метод линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен

(по Лайнуиверу – Бэрку)

Метод Эди – Хофсти основан на преобразовании уравнения Михаэлиса – Ментен путем умножения обеих его частей наV max:

(4.4)

График в координатах V иV /[S] представляет собой прямую линию, пересечение которой с осью ординат дает величинуV max, а отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс, – величинуV max /К М (рис. 4.7). Он позволяет очень просто определять К М иV max , а также выявлять возможные отклонения от линейности, не обнаруживаемые на предыдущем графике.

Рис. 4.7. Метод линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен

(по Эди – Хофсти)

Ингибирование активности ферментов. Действие ферментов можно полностью или частично подавить определенными химическими веществами – ингибиторами . По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на обратимые и необратимые. В основе такого деления лежит прочность связывания ингибитора с ферментом.

Обратимые ингибиторы – это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом и при их удалении активность фермента восстанавливается. Обратимое ингибирование может быть конкурентным, неконкурентным и бесконкурентным.

Примером конкурентного ингибирования является действие структурных аналогов субстрата, которые могут связываться с активным центром фермента похожим способом, как и субстрат, не превращаясь однако в продукт и препятствуя взаимодействию фермента с истинным субстратом, т. е. имеет место конкуренция между субстратом и ингбитором за связывание с активным центром фермента. В результате образования комплексов фермент-ингибитор (EI) концентрация ES-комплексов уменьшается и, как следствие, падает скорость реакции. Иными словами, конкурентный ингибитор уменьшает скорость катализа путем снижения доли молекул фермента, связавших субстрат.

Измерение скоростей реакций при разных концентрациях субстрата позволяет отличать конкурентное ингибирование от неконкурентного. При конкурентном ингибировании на графике зависимости 1/V =f (1/[S]) прямые пересекают ось ординат в одной точке 1/V max независимо от присутствия ингибитора, но в присутствии ингибитора увеличивается тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс, т. е.V max не изменяется, а К М увеличивается, что свидетельствует об уменьшении сродства субстрата к ферменту в присутствии ингибитора (рис. 4.8). Следовательно, при достаточно высокой концентрации субстрата в условиях конкуренции за активный центр фермента, когда субстрат вытесняет ингибитор из активного центра, ингибирование может быть устранено, и скорость катализируемой реакции восстанавливается. При этом уравнение Михаэлиса − Ментен имеет вид

(4.5)

где [I] – концентрация ингибитора; K i – константа ингибирования.

Константа ингибирования характеризует сродство фермента к ингибитору и представляет собой константу диссоциации ЕI-комплекса:

(4.6)

В присутствии конкурентного ингибитора тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс увеличивается на величину (1 + [I]/K i ).

Рис. 4.8. Конкурентное ингибирование:

а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу − Бэрку

При неконкурентном ингибировании ингибитор отличается по структуре от субстрата и связывается не с активным, а с аллостерическим центром фермента. Это ведет к изменению конформации активного центра фермента, что сопровождается снижением каталитической активности фермента. Причем ингибитор может связываться не только со свободным ферментом (Е + I → EI), но и с фермент-субстратным комплексом (ES + I → ESI). Обе формы EI и ESI не активны. Субстрат и ингибитор могут быть одновременно связаны молекулой фермента, но участки их связывания не перекрываются. Действие неконкурентного ингибитора заключается в уменьшении числа оборотов фермента, а не в снижении доли связавших субстрат молекул фермента. Ингибитор не препятствует образованию ES-комплексов, но тормозит превращение субстрата в продукт. Вследствие этого V max уменьшается, т. е. в присутствии ингибитора пересечение прямой с осью ординат произойдет в более высокой точке (рис. 4.9). В той же мере возрастает и тангенс угла наклона прямой к оси абсцисс, равный К М /V max I . К М в отличие от V max не изменяется, поэтому неконкурентное ингибирование не может быть устранено увеличением концентрации субстрата.

Рис. 4.9. Неконкурентное ингибирование:

а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу – Бэрку

Максимальная скорость реакции V max I в присутствии неконкурентного ингибитора описывается уравнением

(4.7)

В частном случае бесконкурентного ингибирования , когда ингибитор связывается только с ES-комплексом и не связывается со свободным ферментом, на графике зависимости 1/V = f (1/[S]) прямые параллельны друг другу и пересекают оси ординат и абсцисс в разных точках (рис. 4.10).

Рис. 4.10. Бесконкурентное ингибирование:

а – схема; б – графическое выражение по Лайнуиверу – Бэрку

Необратимые ингибиторы – это высокореакционноспособные соединения различной химической природы, которые могут взаимодействовать с функционально важными группами активного центра, образуя прочные ковалентные связи. Это приводит к безвозвратной потере активности фермента. В связи с этим теория Михаэлиса – Ментен, основанная на предположении, что присоединение ингибитора к ферменту носит обратимый характер, в данном случае неприменима.

Примером необратимого ингибирования служит взаимодействие ферментов с ионами тяжелых металлов, которые присоединяются к сульфгидрильным группам цистеиновных остатков фермента и образуют при этом меркаптиды – практически недиссоциирующие соединения, либо ковалентная модификация фермента под действием алкилирующих агентов.

(активаторы - повышают, ингибиторы - понижают) Белковые ферменты синтезируются на рибосомах , а РНК - в ядре.

Термины «фермент» и «энзим» давно используют как синонимы (первый в основном в русской и немецкой научной литературе, второй - в англо- и франкоязычной).
Наука о ферментах называется энзимологией , а не ферментологией (чтобы не смешивать корни слов латинского и греческого языков).

История изучения

Термин фермент предложен в XVII веке химиком ван Гельмонтом при обсуждении механизмов пищеварения .

В кон. ХVIII - нач. XIX вв. уже было известно, что мясо переваривается желудочным соком , а крахмал превращается в сахар под действием слюны. Однако механизм этих явлений был неизвестен

Ферменты широко используются в народном хозяйстве - пищевой, текстильной промышленности, в фармакологии.

Классификация ферментов

По типу катализируемых реакций ферменты подразделяются на 6 классов согласно иерархической классификации ферментов (КФ , - Enzyme Comission code). Классификация была предложена Международным союзом биохимии и молекулярной биологии (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Каждый класс содержит подклассы, так что фермент описывается совокупностью четырёх чисел, разделённых точками. Например, пепсин имеет название ЕС 3.4.23.1. Первое число грубо описывает механизм реакции, катализируемой ферментом:

КФ 1: Оксидоредуктазы , катализирующие окисление или восстановление. Пример: каталаза , алкогольдегидрогеназа
КФ 2: Трансферазы , катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы , переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ .
КФ 3: Гидролазы , катализирующие гидролиз химических связей. Пример: эстеразы , пепсин , трипсин , амилаза , липопротеинлипаза
КФ 4: Лиазы , катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов.
КФ 5: Изомеразы , катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата.
КФ 6: Лигазы , катализирующие образование химических связей между субстратами за счет гидролиза АТФ . Пример: ДНК-полимераза

Кинетические исследования

Кривая насыщения химической реакции, иллюстрирующая соотношение между концентрацией субстрата [S] и скоростью реакции v

Простейшим описанием кинетики односубстратных ферментативных реакций является уравнение Михаэлиса - Ментен (см. рис.). На сегодняшний момент описано несколько механизмов действия ферментов. Например, действие многих ферментов описывается схемой механизма «пинг-понг».

Структура и механизм действия ферментов

Активность ферментов определяется их трёхмерной структурой .

Как и все белки, ферменты синтезируются в виде линейной цепочки аминокислот , которая сворачивается определённым образом. Каждая последовательность аминокислот сворачивается особым образом, и получающаяся молекула (белковая глобула) обладает уникальными свойствами. Несколько белковых цепей могут объединяться в белковый комплекс. Третичная структура белков разрушается при нагревании или воздействии некоторых химических веществ.

Чтобы катализировать реакцию, фермент должен связаться с одним или несколькими субстратами. Белковая цепь фермента сворачивается таким образом, что на поверхности глобулы образуется щель, или впадина, где связываются субстраты. Эта область называется сайтом связывания субстрата. Обычно он совпадает с активным центром фермента или находится вблизи него. Некоторые ферменты содержат также сайты связывания кофакторов или ионов металлов.

У некоторых ферментов есть сайты связывания малых молекул, они могут быть субстратами или продуктами метаболического пути, в который входит фермент. Они уменьшают или увеличивают активность фермента, что создает возможность для обратной связи.

Для активных центров некоторых ферментов характерно явление кооперативности .

Специфичность

Ферменты обычно проявляют высокую специфичность по отношению к своим субстратам. Это достигается частичной комплементарностью формы, распределения зарядов и гидрофобных областей на молекуле субстрата и в центре связывания субстрата на ферменте. Ферменты демонстрируют высокий уровень стереоспецифичности, региоселективности и хемоселективности.

Модель «ключ-замок»

Гипотеза Кошланда об индуцированом соответствии

Более реалистичная ситуация в случае индуцированного соответствия. Неправильные субстраты - слишком большие или слишком маленькие - не подходят к активному центру

В 1890 г. Эмиль Фишер предположил, что специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата . Такое предположение называется моделью «ключ-замок». Фермент соединяется с субстратом с образованием короткоживущего фермент-субстратного комплекса. Однако, хотя эта модель объясняет высокую специфичность ферментов, она не объясняет явления стабилизации переходного состояния, которое наблюдается на практике.

Модель индуцированного соответствия

В 1958 г. Дениел Кошланд предложил модификацию модели «ключ-замок» . Ферменты, в основном, - не жесткие, а гибкие молекулы. Активный центр фермента может изменить конформацию после связывания субстата. Боковые группы аминокислот активного центра принимают такое положение, которое позволяет ферменту выполнить свою каталитическую функцию. В некоторых случаях молекула субстрата также меняет конформацию после связывания в активном центре. В отличие от модели «ключ-замок», модель индуцированного соответстия объясняет не только специфичность ферментов, но и стабилизацию переходного состояния.

Модификации

Многие ферменты после синтеза белковой цепи претерпевают модификации, без которых фермент не проявляет свою активность в полной мере. Такие модификации называются посттрансляционными модификациями (процессингом). Один из самых распространенных типов модификации - присоединение химических групп к боковым остаткам полипептидной цепи. Например, присоединение остатка фосфорной кислоты называется фосфорилированием, оно катализируется ферментом киназой . Многие ферменты эукариот гликозилированы, то есть модифицированы олигомерами углеводной природы.

Еще один распространенный тип посттранляционных модификаций - расщепление полипептидной цепи. Например, химотрипсин (протеаза , участвующая в пищеварении), получается при выщеплении полипептидного участка из химотрипсиногена. Химотрипсиноген является неактивным предшественником химотрипсина и синтезируется в поджелудочной железе . Неактивная форма транспортируется в желудок , где превращается в химотрипсин. Такой механизм необходим для того, чтобы избежать расщепления поджелудочной железы и других тканей до поступления фермента в желудок. Неактивный предшественник фермента называют также «зимогеном».

Кофакторы ферментов

Некоторые ферменты выполняют каталитическую функцию сами по себе, безо всяких дополнительных компонентов. Однако есть ферменты, которым для осуществления катализа необходимы компоненты небелковой природы. Кофакторы могут быть как неорганическими молекулами (ионы металлов, железо-серные кластеры и др.), так и органическими (например,

Ферментативная активность почв [от лат. Fermentum - закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы.

Биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность ферментов изменяется по генетическим горизонтам, которые отличаются по содержанию гумуса, типам реакций, окислительно-восстановительным потенциалом и другими показателями по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или Ап, имеют низкую активность ферментов. Активность их незначительно возрастает при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой резко снижается, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных почвах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

Ферментативная активность отражает состояние плодородия почв и внутренние изменения, происходящие при сельскохозяйственном использовании и повышении уровня культуры земледелия. Эти изменения обнаруживаются как при вовлечении целинных и лесных почв в культуру, так и при различных приемах их использования .

По всей Беларуси в пахотных почвах ежегодно теряется до 0,9 т/га гумуса. В результате эрозии ежегодно безвозвратно уносится с полей 0,57 т/га гумуса. Причинами дегумификации почв являются усиление минерализации почвенного органического вещества, отставание процессов новообразования гумуса от минерализации в связи с недостаточным поступлением в почву органических удобрений и снижения ферментативной активности почвы .

Биохимические превращения органического вещества почвы происходят в результате микробиологической деятельности под влиянием ферментов. ферментативный активность почва микроорганизм

Особую роль играют ферменты в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате питательные вещества из трудно усвояемых соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Благодаря каталитической функции они обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций .

Совместно с другими критериями ферментативная активность почв может служить надёжным диагностическим показателем для выяснения степени окультуренности почв. В результате исследований 4, с. 91 установлена зависимость между активностью микробиологических и ферментативных процессов и проведением мероприятий, повышающих плодородие почв. Обработка почв, внесение удобрений существенно изменяют экологическую обстановку развития микроорганизмов.

В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию .

Интерес к применению ферментов вызван еще и тем, что постоянно возрастают требования по увеличению безопасности технологических процессов. Присутствуя во всех биологических системах, являясь одновременно продуктами и инструментами этих систем, ферменты синтезируются и функционируют при физиологических условиях (pH, температура, давление, присутствие неорганических ионов), после чего легко выводятся, подвергаясь разрушению до аминокислот. Как продукты, так и отходы большинства процессов, протекающих с участием ферментов, являются нетоксичными и легко разрушаемыми. Кроме того, во многих случаях, ферменты, используемые в промышленности, получают экологически безопасным путем. От небиологических катализаторов ферменты отличают не только безопасность и повышенная способность к биодеградации, но и специфичность действия, мягкие условия протекания реакций и высокая эффективность. Эффективность и специфичность действия ферментов позволяет получать целевые продукты с высоким выходом, что делает использование ферментов в промышленности экономически выгодным. Применение ферментов способствует сокращению расхода воды и энергии в технологических процессах, уменьшает выбросы в атмосферу CO2, снижает риск загрязнения окружающей среды побочными продуктами технологических циклов .

Применением передовой агротехники можно изменять в благоприятную сторону микробиологические процессы не только пахотного, но и подпахотного слоев почвы.

При непосредственном участии внеклеточных ферментов происходит разложение органических соединений почвы. Так, протеолитические ферменты расщепляют белковые вещества и до аминокислот.

Уреаза разлагает мочевину до СО2 и NH3. Образующийся аммиак и аммонийные соли служат источником азотного питания растений и микроорганизмов.

Инвертаза и амилаза участвуют в расщеплении углеводов. Ферменты группы фосфатов разлагают фосфорорганические соединения почвы и играют важную роль в фосфатном режиме последней.

Для характеристики общей ферментативной активности почвы обычно используют наиболее распространенные ферменты, свойственные подавляющему большинству почвенной микрофлоры - инвертазу, каталазу, протеазу и другие .

В условиях нашей республики проводилось немало исследований 16, с. 115 по изучению изменения уровня плодородия и ферментативной активности почв при антропогенном воздействии, однако полученные данные не дают исчерпывающий ответ на характер изменений из-за сложности сопоставления результатов в виду различия условий проведения опытов и методик исследований.

В связи с этим поиск оптимального решения проблемы улучшения гумусного состояния почвы и ее ферментативной активности в конкретных почвенно-климатических условиях на основе разработки ресурсосберегающих приемов основной обработки почвыё применения почвозащитных севооборотов, способствующих сохранению структуры, предотвращению переуплотнения почвы и улучшению их качественного состояния и восстановлению плодородия почв при минимальных затратах, весьма актуален.